华银康单细胞转录组项目送样指导 | 单细胞篇
2023-05-11 阅读数：2153
单细胞转录组测序平台能实现高通量的细胞捕获，能够一次性分离、并标记500–10000个单细胞，从而获得每个细胞的3’端的转录组信息。具有细胞通量高、建库成本低、捕获周期短等优势。该技术主要用于细胞分型和标记因子的鉴定，从而实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，此外该技术还可以预测细胞分化与研究发育轨迹，在当下疾病、免疫、肿瘤领域以及组织、器官、发育研究中发挥越来越重要的作用。迄今为止，研究的样本类型已有来自肿瘤，干细胞，胚胎，神经系统等多个不同部位，理论上真核生物都能进行单细胞转录组测序。在样本选择好之后，实验结果是否理想，很大程度取决于样本的质量，下面是样本准备以及推荐样本量的介绍，供广大科研工作者参考。
样本类型以及处理运输
1.组织样本
1.1新鲜组织样本
（新鲜组织包含实体肿瘤组织及其他病理组织），目前组织成功解离经验包含组织如下：
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人 |
小鼠 |
大鼠 |
猪 |
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外周血 肾脏 肝脏 皮肤 肺 黄韧带 乳腺（癌） 胰腺（癌） 骨髓 气道组织 动脉瓣膜 结直肠（癌） 阑尾 胃黏膜 胃（癌）-原位和转移灶 |
脑
肾脏
食道癌皮下组织
胰腺
肝脏
睾丸
坐骨神经
视网膜
股骨
胫骨 |
股骨 胫骨 坐骨神经 肾脏 肝脏
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卵巢
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（以上表格中组织可直接联系实验员送样，不在上表中的其他送样组织，如果不了解组织特性，请咨询相关人员）
组织样本要求：大于0.2g实体瘤组织，保护液能完全浸没组织为宜，如样本量足够建议首次寄送时同一样本2~3管重复。收到组织保存液后，及时使用，以免过保：将适量样本用无菌生理盐水清洗干净血渍后，放入装有组织保存液的储存管中，迅速盖紧加封口膜包装好；无菌操作：操作过程遵循无菌操作，样本污染可能会对后续数据质量造成严重影响，一定注意无菌操作。
样品包装：样本运输环境为 2-8℃，可冰袋寄送（注意不要选择干冰），装有样本的储存管不能和冰袋直接接触，需用泡沫填充或包裹间隔，只有碎冰和冰水混合物样本管可以接触。
样本寄送：样本保存液对新鲜样本的保存时间为 2-8℃，48小时，务必保证在48小时内到达实验室。如销售协助样本运输，可将样本管插入碎冰运输，请尽量保证样本在当天下午3: 00前送达，当天解离细胞并开展实验；当天未能送达的，次日解离细胞并开展实验。请尽量保证样本在工作日送达；如不能保证样本在48小时内送达的，请销售和客户、实验人员商议，满足现场解离条件的，可协调现场解离上机或冻存。
1.2冰冻组织样本
冻存样本寄送建议:
（1） 样本冻存：建议组织剪成1~2mm3，0.2~0.5g/管为宜；将取下的样本直接放入液氮速冻，不需要清洗，然后-80℃保存；
（2） 样本寄送：如样本量足够建议首次寄送时同一样本2~3管重复，以防万一；样品做好标记，随样本寄送《单细胞送样信息表》，建议干冰用量15~20公斤（夏季可以适度增加）。
细胞样本
2.1贴壁细胞
样本要求：从培养箱中取出细胞培养瓶或培养板，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好且无污染；倒弃培养基，向细胞培养瓶或培养皿中加入适量预冷的PBS，洗2次；弃尽PBS，加入适量相应的消化酶进行消化，利用完全培养基终止反应；细胞计数，按照 1×106个细胞每管进行分装，准确标记后将分装好的细胞500g，4℃离心5min，弃掉上清。样本保存与梯度冻存：
（1）组织保存液保存（适用于短时间运输）：每管细胞用1 mL组织保存液重悬细胞，轻轻吹打混匀，封口膜封口；
（2）梯度冻存（适用于长时间运输）：每管细胞用1mL预冷细胞冻存液（高糖DMEM牛血清：DMSO=7: 2: 1） 重悬细胞，轻轻吹打混匀，转移至细胞冻存管内，封口膜封口；将装有细胞的冻存管放入装有异丙醇的梯度冻存盒中，再将冻存盒放入-80℃冰箱冻存凝固。（冻存盒的冻存速度接近每分钟1℃，这样计算的话，从25℃降到-80℃，要2小时冻存完成）
没有梯度冻存盒的话，在冰箱里梯度降温：先4℃ 10min，后-20℃ 30min，最后转移至-80℃冰箱内过夜，过夜后，可将细胞转移至液氮中保存；
（3）为确保实验的顺利，建议样本备份1-2份，1×106个/份，以防备部分样品降解重新取材，制备或送样，耽误时间。样本量：3×104到1×106个活细胞（细胞活性大于80%）。（4）运输方式：使用组织保存液保存的细胞样本，冰袋或碎冰运输，建议取样后24小时内送达实验室；使用梯度冻存的细胞样本，将冻存管置于密封好的塑料袋中，并在泡沫盒中装入足量的干冰进行运输
注：冻存会影响细胞活性和实验成功率；建议取样后尽快送样，非必要不进行冻存，以保证细胞活性。
2.2悬浮细胞
样本要求：确定细胞生长状态良好且无污染；细胞计数，按照 1×106个细胞每管进行分装，准确标记后将分装好的细胞500g，4℃离心5min，弃掉上清；加入500μL预冷PBS洗涤，500g，4℃离心5min，弃掉上清；
样本保存与梯度冻存：
（1）组织保存液保存（适用于短时间运输）：每管细胞用1mL组织保存液重悬细胞，轻轻吹打混匀，封口膜封口；
（2）梯度冻存（适用于长时间运输）：每管细胞用1mL预冷细胞冻存液（高糖DMEM牛血清：DMSO=7: 2: 1） 重悬细胞，轻轻吹打混匀，转移至细胞冻存管内，封口膜封口；将装有细胞的冻存管放入装有异丙醇的梯度冻存盒中，再将冻存盒放入-80℃冰箱冻存凝固。（冻存盒的冻存速度接近每分钟1℃，这样计算的话，从25 ℃降到-80℃，要2小时冻存完成）。
没有梯度冻存盒的话，在冰箱里梯度降温：先4℃ 10min，后-20℃ 30min，最后转移至-80℃冰箱内过夜，过夜后，可将细胞转移至液氮中保存；
（3）为确保实验的顺利，建议样本备份1-2份，1×106个/份，以防备部分样品降解重新取材，制备或送样，耽误时间。样本量：3×104到1×106个活细胞（细胞活性大于80%）
（4）运输方式：使用组织保存液保存的细胞样本，冰袋或碎冰运输，建议取样后24小时内送达实验室；使用梯度冻存的细胞样本，将冻存管置于密封好的塑料袋中，并在泡沫盒中装入足量的干冰进行运输。
样本类型以及处理运输
血液样本对样本实效性要求最高，需要在采集样品后数小时内完成样本的细胞分离和处理，主要分离和富集PBMCs，并可能涉及单细胞多个组学产品的联合应用（如转录组、细胞表面蛋白Panel、TCR/BCR 等）；血液样本的制备需要提前和客户确定好方案，询产品经理和实验人员确定好采血量、分离方案、筛选方案等，再行样品准备。
血液样本寄送建议：
（1） 客户确定方案后，确定采血量，用抗凝管进行采样，建议使用枸缘酸钠的抗凝管（金黄色盖，最优）或EDTA抗凝管（紫色盖）采集血样，采样后轻轻颠倒管身数次，室温平放 5 分钟，期间可轻摇管身，避免剧烈摇晃造成凝血；室温2小时内送达或加等体积常温1xPBS，轻轻混匀，室温2小时内送达；
（2） 如需要进行细胞分选、分离粒细胞、或从其他组织内（如肝脏、脾脏、骨髓等）分离单核细胞，或需要开展多个组学的研究，需提前沟通，确定实验方案、特殊试剂货期（如Panel 抗体），再行安排样品采集；
（3） 血液样本采样前，需要提前至少一天和实验人员预约；
（4） 采血量建议：单一组学建议每个样本采血2-3mL（有条件可多采一份备份使用），可获得百万级的PBMCs；如果涉及2个以上组学或需要多样本SMK标记的，建议5mL以上；如果涉及细胞分选，需根据标的细胞占比和数量确定采血量或咨询相关人员；需要检测组织内免疫细胞的可根据组织内免疫细胞文献数据适当提高解离组织用量。
高通量测序检测中心
中心定位于科研服务与临床医学转化应用，围绕基础科研和临床检测两大板块，致力于生物医学各领域的相关研究与测序大数据联合分析，为各大高校、医院和科研单位提供医学科研项目的方案设计、测序实验和数据分析为一体的一站式服务以及快速精准的临床检测服务，以成为业内领先的高通量测序服务中心为目标。
目前，我司高通量测序检测中心拥有Illumina和MGI等高通量测序仪组成的大规模高通量测序服务平台，科研服务可提供涵盖基因组学、转录组学（外泌体）、表观组学、单细胞组学、微生物组学、免疫组库、代谢组学、蛋白组学和多组学关联分析等组学基础研究服务和高级生物信息分析；临床服务包括遗传性肾病基因检测、血液肿瘤基因检测、实体瘤基因检测、感染性疾病病原体检测等服务。
如需了解更多有关高通量测序相关信息，欢迎拨打我司高通量全国服务热线：020-38917402、020-38917464
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