细菌基因组测序/小基因组测序(10K~1M的DNA序列)

       细菌不但个体微小，其基因组也比动植物小得多，一般在10M以内。微生物基因组测序能够检测微生物全基因组的核苷酸变异，通过全基因组测序，研究人员可以找到大量的单核苷酸多态性位点(SNP)、拷贝数变异(CNV)、插入缺失(InDel)、结构变异(SV)等变异信息，应用范围涉及临床医药研究、微生物致病性研究、物种进化分析等领域。

       1、实验方案

    测序策略：Illumina MiSeq PE250/PE300

     数据量：推荐测100×以上

2、数据分析

 2.1 标准信息分析

（1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估

（2）K-mer分析以及基因组大小估计

（3）序列组装

（4）组装基因组的深度和覆盖度分析

（5）组装结果的核酸库比对分析

（6）基因预测

（7）基因功能注释(GO-COG/KOG)

（8）基因生物通路注释(KEGG)

 2.2 高级信息分析

（1）基因组详细信息环形图

（2）共线性分析

（3）基因家族分析

（4）CRISPR预测

（5）基因岛预测（毒力岛）

（6）前噬菌体预测

（7）分泌蛋白预测

（8）动植物病原菌致病性分析等

 3、技术流程

4、案例分析

案例（1）高通量测序分析发现新细菌

德国微生物学与细胞培养研究所微生物系最近从咸水环境微生物垫的低氧过渡区中分离培养获得了一种中度嗜盐，专性厌氧，分解糖类的细菌，并编码代号为L12-Fru-AB^T。利用16s测序分析后发现该微生物应该代表着一个新的种属，研究发现该菌在各种缺/微氧环境中都广泛存在，比如咸水环境，沸水和动物肠道；随后，研究人员利用全基因组测序方法对该菌进行基因组序列分析，结合该菌的表型，推断出L12-Fru-AB^T该菌及其相关细菌是能够专门适应和利用微生物垫或生物膜产生的硫酸化的甘油聚合物。

图1 基于16s rRNA基因测序的L21-Fru-AB^T在发育树的位置图

图2 K.glycovorans L21-Fru-AB^T和几个PVC superphylum的代表性细菌的基因组系统发育构成成分

案例（2）耐盐耐碱性的克雷伯氏菌.D5A全基因组分析

中国科学院南京土壤研究所研究人员利用Hiseq2000测序平台，采用Pair-end测序和mate pair测序的技术对克雷伯氏菌.D5A种属进行了全基因组测序，并对测序数据进行了系统性分析。研究其有利于促进植物生长的相关基因，尤其是与耐盐耐碱等相关基因。结果发现克雷伯氏菌.D5A种属的基因组共为5,540,009bp，GC含量占57.15%，同时注释了一些基因比如3-吲哚乙酸（IAA）合成基因，溶磷作用基因，含体细胞生成基因，羟基丁酮和2,3-丁二醇合成基因，还有固氮功能基因等。

图1 Klebsiella sp. D5A种属代谢通路和转运系统一览图

       参考文献