小RNA是一类高度保守的小RNA分子，它可以参与基因表达与调控、RNA的加工与剪切、蛋白质翻译、遗传“入侵”抑制、配子发生等重要生物学过程，是生命活动中必不可少的调控因子。小RNA测序技术采用胶分离技术，收集样本中18-30nt的RNA片段，利用高通量测序技术对样本中所有small RNA家族进行测序和表达定量，从而解析miRNA 、siRNA 、piRNA 其它非编码RNA等序列，并预测新的小RNA及其靶基因。
1、实验方案
测序策略：Illumina NextSeq 500 SE50
数据量：推荐10M clean reads
2、技术优势
（1）通量高：一次测序得到上千万条序列；
（2）分辨率高：可以检测小RNA单个碱基的差异；
（3）精准度高：从几个到几十万个拷贝精确计数；
（4）可重复性好：深度测序保证了抽样随机性，重复性好，无需重复实验；
（5）检测范围广：既能鉴定已知小RNA，又能发现新的小RNA。
3、信息分析
3.1 标准信息分析
（1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估；
（2）样品间的公共序列和特异序列分析；
（3）小RNA与参考基因组比对分析；
（4）按照优先级将小RNA进行分类注释
（5）Novel Small RNA预测；
（6）样本间miRNA差异表达分析；
（7）已知miRNA的家族分析；
（8）已知miRNA差异分析（≥2个样本）和聚类分析（≥3个样本）；
（9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因预测；
（10）已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注释和KEGG通路分析；
（11）novel miRNA差异分析（≥2个样本）和聚类分析（≥3个样本）；
（12）差异miRNA靶基因预测；
（13）已知miRNA的碱基编辑分析；
3.2 高级信息分析
（1）snoRNA注释
（2）piRNA注释
（3）mir2disease注释
4、技术流程
5、案例分析
案例（1）小鼠早期胚胎发育过程中小RNA的动态变化及其生物学功能
该研究利用优化的方法系统解析了小鼠卵子到受精后8细胞胚胎发育过程中的小RNA动态变化，发现小鼠卵子和早期胚胎主要包含三类小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的这三类小RNA绝大多数来源于卵子，由精子带入卵子的小RNA不足几百分之一。随着胚胎的发育，母源endo-siRNA和piRNA逐渐被缓慢降解。而母源miRNA的降解较快，主要发生在胚胎2细胞期前后。合子中新表达的miRNA最早出现在受精卵第一次分裂前，并随着胚胎的发育持续被激活表达，特别是进化保守的miRNA的表达量迅速上升。研究人员进一步结合小鼠早期胚胎发育的转录组数据进行分析，发现miRNA在卵子到胚胎2细胞期中几乎没有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8细胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能开始逐步恢复，并对合子激活表达的基因有明显的靶向抑制作用。以上研究不仅揭示了小鼠早期胚胎发育中miRNA的表达和降解规律，还发现了miRNA对靶基因的调控活性随着胚胎发育而被动态调控的现象，对于理解miRNA在早期胚胎发育中的功能和机制具有重要意义。
图1 卵母细胞和早期胚胎中miRNA表达的动态变化
本研究通过高通量测序方法对小RNA长度进行分类，绘制前列腺上皮（PrEC）和间质细胞（PrSC）miRNA图谱。PrEC测序共得到近76M reads，其中860468条为特异性序列。PrSC测序得到近76M reads，其中1百万条为特异性序列。鉴定得到许多高度保守及不保守的miRNA家族。与PrEC相比，16条在PrSC中显著高表达的miRNA得到进一步分析。结果表明，这16条miRNA的靶点基因主要涉及附着连接、细胞附着、EGRF、TGF-β和雄激素信号。肿瘤抑制Let-7家族miRNA在两株细胞中高度表达。此外，鉴定得到PrEC和PrSC细胞中特异性表达的miRNA，预测它们的作用靶点为一组转录因子。
图1 PrEC和PrSC的小RNA表达聚类分析
图2 功能基因重叠
参考文献
[1] Yang et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances, 2016.
[2] Singh et al. Deep sequencing of small RNA libraries from human prostate epithelial and stromal cells reveal distinct pattern of microRNAs primarily predicted to target growth factors. Cancer Letters, 2016.
