长链非编码 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度在200nt以上且不编码蛋白质的RNA，以带polyA尾和不带polyA尾两种形式广泛存在于各种生物体内，参与细胞内多种过程调控，具有跨物种的低保守性，组织特异性表达和丰度低等特点。
近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰和核内运输等多种重要的调控过程，但绝大部分lncRNA的功能目前仍不清楚。应用高通量测序技术，研究人员能够快速获得与疾病或者特定生物学过程相关的lncRNA 并进行深入研究。
1、实验方案
测序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150
数据量：推荐12G clean data
2、技术优势
（1）任意物种检测：相对传统芯片而言，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因或基因组信息，能够直接对任何物种进行最全面的转录组分析；
（2）分辨率高：可以检测转录本中单碱基的差异；
（3）检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定正常和稀有的转录本；
（4）信息分析广：可以做基因差异表达分析、可变剪切、融合基因分析；新转录本预测及注释。
3、 数据分析
3.1 标准信息分析
（1）数据过滤及质量评估
（2）核糖体RNA去除率计算
（3）比对参考基因组及统计
（4）基因表达水平分析
（5）基因表达差异及聚类分析
（6）差异基因KEGG生物通路富集分析（仅限于模式物种）
（7）差异基因GO功能富集分析（仅限于模式物种）
（8）已知mRNA表达量分析
（9）已知mRNA差异表达及聚类分析
（10）已知lncRNA表达量分析
（11）已知lncRNA差异表达及聚类分析
（12）预测新lncRNA
（13）新lncRNA鉴定和表达量分析
（14）新lncRNA差异表达及聚类分析
（15）新lncRNA家族分析
（16）SNP和InDel检测与注释
（17）生物学重复样品间相关性分析
（18）蛋白互作网络分析
（19）基因融合
（20）主成份分析（PCA）
（21）特征性差异表达基因分析
（22）lncRNA保守性分析
（23）可变剪切
3.2 高级分析
（1）已知mRNA-lncRNA共表达网络构建
（2）基因结构优化及优化基因的表达值计算
（3）eQTL分析
4、技术流程
5、案例分析
案例（1）瘦猪和肥胖猪组织中lncRNA的表达水平不同
该研究对猪的两个品种陆川和杜洛克的肝脏、肌肉和脂肪组织分别进行了lncRNA测序，共鉴定出4868个lncRNA转录本，其中3235个为新转录本，而且lncRNA和mRNA的表达模式是组织特异性的。脂肪组织中差异表达的lncRNA具有794个潜在的靶基因，这些靶基因富集到脂肪细胞因子信号通路、PI3k-Akt信号通路和钙离子信号通路。此外，差异表达的lncRNA位于13个脂肪相关的数量性状位点，其中包括65个QTL_ID。接着，分析了同一QTL_ID中的lncRNA和mRNA，并通过qPCR证实了其在两个QTL_ID中的共表达。该研究为两个猪品种脂肪代谢差异的分子机理提供了新的观点，为进一步研究lncRNA在肥胖发育中的调控作用奠定了重要基础。
图1 组织中lncRNA和mRNA的差异表达
图2 lncRNA和mRNA差异表达的热图
案例（2）长非编码RNA控制造血干细胞功能
造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有独特的基因表达程序，能够自我更新和分化成各类成熟血细胞。长非编码RNA（lncRNA）已成为基因表达和细胞命运决定的重要调节因子，尽管它们在HSC中的功能尚不清楚。该研究对纯化的HSC进行lncRNA测序，鉴定出323个未注释的lncRNA。比较这些lncRNA在差异谱系中的表达显示159个lncRNA富集于HSC，其中一些可能是是HSC特异性的（LncHSC）。这些lncRNA基因与编码蛋白基因具有相似的表观遗传学特征，如通过DNA甲基化调节表达。敲低两种LncHSC对HSC自我更新和谱系定型产生了的不同影响。该研究结果表明，lncRNA在HSC调控中起重要作用，为HSC调控的遗传回路提供了一个新的思路。
图1 HSC特异的lncRNA的鉴定
参考文献
[1] Yu et al. Comparative analyses of long non-coding RNA in lean and obese pig. Oncotarget, 2017.
[2] Luo et al. Long non-coding RNAs control hematopoietic stem cell function. Cell Stem Cell, 2015.
