CLIP- Seq，即紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（crosslinking-immunoprecipitation and high-throughput sequencing），是一项在全基因组水平揭示RNA分子与RNA结合蛋白相互作用的革命性技术。
主要原理是基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生耦联，以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀之后，回收其中的RNA片段，经添加接头、RT-PCR等步骤，再对这些分子进行高通量测序和生物信息学的分析，从而深入揭示RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其对生命的意义。
最近几年，这项技术也被应用到miRNA靶标鉴定等工作中。在动物体内，成熟的单链miRNA与一系列蛋白形成miRNA诱导的沉默复合物（RISC），结合于靶mRNA的3"-UTR 区，阻止所结合的mRNA的翻译或直接降解靶miRNA。基于这一原理，我们可以通过CLIPSeq技术来进行mRNA靶基因的筛选。CLIP-Seq方法的应用能够非常明显地降低miRNA结合位点的假阳性预测频率，并且减小miRNA结合位点搜寻空间的范围，可以在全基因组范围内鉴定AGO2蛋白在不同RNA上的结合位点。
1、实验方案
测序策略：Illumina NextSeq 500 SE50
数据量：20M clean reads
2、技术优势
（1）全转录组覆盖：与CLIP芯片相比，可在全转录组范围对蛋白结合位点进行筛选与鉴定；
（2）高灵敏度：每个样本可获得数百万条的序列标签，可发现研究转录组上稀有的蛋白结合位点；
（3）准确性高： 从活细胞交联开始，反应了体内环境下真实的分子间相互作用；
（4）特异性强： 紫外辐射不会造成蛋白和蛋白之间的交联，只会鉴定出蛋白和 RNA 之间的相互作用；
（4）应用范围广： 特别适用于研究剪接因子RNA结合图谱、miRNA作用靶点等研究。
3、数据分析
（1）将reads比对到基因组：将预处理reads与reference genome进行mapping，最后得到mapping的sam结果文件，给出mapping结果统计；
（2）peak detect：应用sam文件进行peak富集区查找；
（3）motif detect：查找结合位点区结构特性，寻找转录因子结合区域的motif结构；
（4）基因关联：应用结合位点区位置，确定其周围所涉及的基因；
（5）关联基因GO差异分析：以参考基因组为背景集对结合位点关联基因进行GO富集分析。
4、技术流程
5、案例分析
案例（1）依赖SIRT7去乙酰基的U3-55K蛋白控制的rRNA前体加工
SIRT7是一种NAD+依赖蛋白脱乙酰酶，在核糖体合成及细胞增殖中具有重要作用。以往的研究已经证实SIRT7与RNA聚合酶I 相关联，它与pre-rRNA相互作用促进rRNA合成。德国肿瘤研究中心小组成员通过研究表明SIRT7也与小核仁RNP相关联，参与pre-rRNA的加工和rRNA的成熟，实验通过将标记的SIRT7从紫外交联的HEK293T细胞中进行免疫沉淀，然后获取沉淀RNA进行测序，最后进行序列分析。敲除SIRT7会损害依赖U3 snoRNA的早期断裂步骤，而这一步对18sRNAde 生成是必不可少的。从机制上来看，SIRT7脱去乙酰基U3-55k，它是U3 snoRNA复合物的一个核心成分，这个可逆的乙酰化作用调节U3-55k与U3 snoRNA的结合。SIRT7的脱乙酰作用促进U3-55k与U3 snoRNA的结合，是pre-rRNA进行加工的先决条件。在压力条件下，SIRT7从核仁被释放，导致U3-55k高度乙酰化，减弱pre-rRNA的加工。结果显示SIRT7在核糖体合成中具有多种作用，调节rRNA的转录和加工。
图1 SIRT7与pre-rRNA和snoRNA关系图
案例（2） ALS相关蛋白TDP-43、FUS和TAF15功能的异同
肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种以运动神经元、脑干和脊椎渐进性退化为特点的绝症。本研究展示了RNA代谢过程中FUS、TAF15和TDP-43的功能异同。RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP）TAF15、FUS和TDP-43与ALS有关。为了比较三个RBP的功能差异，本文运用CLIP-Seq和RNA Bind-N-Seq技术对成年小鼠脑进行研究，揭示TAF15可富集得到约4900条含有GGUA基序的RNA。TAF15与FUS在内含子中表现出相似的结合模式。但是不同于FUS和TDP-43，TAF15在差异性剪切中仅起到微小的作用。在人的神经祖细胞中，TAF15和FUS会影响靶RNA的稳定性。源自人干细胞分化得到的运动神经元细胞中，TAF15和FUS同时缺失的RNA图谱与ALS患者纤维母细胞中FUS R521G突变展现出相似的结果。
图1 TAF15对一个转录本小子集差异性剪切的影响
参考文献
[1] Chen et al. SIRT7-dependent deacetylation of the U3-55k protein controls pre-rRNA processing. Nature Communications, 2016.
[2] Kapeli et al. Distinct and shared functions of ALS-associated proteins TDP-43, FUS and TAF15 revealed by multisystem analyses. Nature Communications, 2016.
