16S rDNA测序是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA分子所对应的DNA序列，序列全长约1540bp，由10个保守区和9个可变区（V1-V9）组成。保守区序列在细菌间差异不大而高变区则具有种属特异性，因此最常用作细菌分类标准。通过提取环境样品DNA，扩增其中16S rDNA基因（常见扩增区域：V×4区、V3-V4区、V4-V5区），对片段进行高通量测序并与细菌注释数据库比对，从而完成对样品细菌种类、丰度、差异菌群和系统进化等诸多信息分析。这对于研究微生物菌群和疾病之间的发病机制等方面发挥着重要的作用。

应用方向

1. 健康和疾病人群细菌分类鉴定、属菌丰度统计、差异菌群Biomarker 筛选

2. 疾病与微生物菌群之间发病机制的研究；

实验方案

测序策略: Illumina NovaSeq 6000，PE250

数据量:每个样>5万条raw reads

技术优势

1. 与微生物传统鉴定方法相比，16S rDNA测序可以鉴定出许多不能纯化培养的新菌种，方法简便快捷、精确度高、重复性更好；

2. 测序数据量少，具有较低的成本，性价比较高；

3. 可以针对一个或多个可变区进行序列读取，能更准确的进行细菌分类鉴定；

4. 可以鉴定出低丰度细菌，灵敏度更高；

技术流程

图1 16S rDNA测序实验流程

数据分析

(1)按标准流程进行数据整理及数据质量评估;

(2) Tags拼接、过滤;

(3)物种组成分析(与RDP,Silva,GreenGene等数据库比对) ;

(4) OTU统计及venn图分析;

(5) OTU Rank曲线;

(6)物种积累曲线;

(7)物种注释及其丰度分析(柱状图和热图分析)

(8)物种系统进化分析;

(9)单个样本复杂度分析(α多样性分析);

(10)样本间/组间α多样性差异统计分析及盒形图;

(11)样品间复杂度分析: β多样性heatmap分析;

(12) β多样性PCoA分析(2D/3D);

(13) NMDS-2D/3D分析；

(14)样本组间差异分析: Adonis分析,相似性分析,RDA/CCA分析等;

(15)不同样本间物种组成聚类分析(样品数>=3)

(16)其他高级分析:比如PICRUSt预测宏基因组的功能组成。

送样建议

样本来源：人、大鼠和小鼠（其它样本类型请咨询）

粪便样本>2g/样

肠道内容物>100μL/样

运输条件：干冰运送

结果展示

图2 Control-vs-Teatment OTU Venn图

（在在97%的相似度下，得到了每个样品的OTU数，利用Venn图可以展示多样品共有和各自特有OTU数目，直观展示样品间OTU的重叠情况。结合OTU所代表的物种，可以找出不同环境中的核心微生物。图中不同颜色图形代表不同样品或者不同组别，不同颜色图形之间交叠部分数字为两个样品或两个组别之间共有的OTU个数。）

图3 样本Phylum 水平物种丰度组成

图4 组间Phylum 水平物种丰度组成

图5 样本Phylum水平物种丰度热图

图6 组间Phylum水平物种丰度热图

图7 组间Alpha多样性盒形图

（组间Alpha多样性盒形图，更直观显示组间Alpha多样性差异。盒形图可以显示5个统计量（最小值，第一个四分位数，中位数，第三个中位数和最大值，及由下到上的5条线），异常值以“o”标。）

图8 基于LDAscore筛选的biomarker

图9 特征物种的柱状环形图

案例分析 ：利用16S rDNA 测序对复发性胆总管结石进行微生物群分析

Microbiota analysis with next-generation 16S rDNA gene sequencing in recurrent common bile duct stones[1].

研究方案：内镜下逆行胰胆管造影术（ERCP）是胆结石的主要治疗方法，但术后复发率很高。最近研究表明胆道微生物群参与胆石症的发病机制。然而胆道微生物群失调与复发性胆石症相关性机制尚未得到研究；本课题通过收集5例复发性（CBD）结石（FF）患者和45例原发性CBD结石（YF）患者的胆汁标本进行16S rDNA 测序。

研究结果：在门水平上，变形菌门（proteobacteria）和厚壁菌门（firmicutes）是主要的菌属，FF患者的变形菌门（proteobacteria）含量比较高。此外，FF患者的拟杆菌（Bacteroidetes）和放线菌（actinobacteria）含量低。YF患者胆汁中的微生物菌群比FF患者胆汁中的分布更均匀。进一步研究发现FF患者胆汁微生物多样性降低。在属水平上，克雷伯氏菌（klebsiella）在FF患者中占主导地位，而埃希氏志贺氏菌（Escherichia-shigella）在YF患者中占主导地位。此外，FF患者中的克雷伯氏菌高于YF患者。本研究发现了复发性CBD结石FF患者和YF患者之间的微生物菌群在属水平上的差异，这为胆道微生物群变化与复发性CBD结石之间的关系提供了新的见解。

图10. YF和FF患者胆汁中微生物菌群的多样性分析

参考文献：Tan W, Chen R, Song J, et al. Microbiota analysis with next-generation 16S rDNA gene sequencing in recurrent common bile duct stones[J]. Annals of Translational Medicine, 2022, 10(10).